Nat Commun两文齐发 | 实验室与合作团队实现TadA及同源蛋白筛选改造与高精度迷你碱基编辑器的开发

人类遗传病的所有致病遗传变异中，超过60%都是单碱基点突变，但如何高效精准的诱导及修复致病点突变以开展功能及治疗探索长期困扰着领域内的研究者。2016年以来，哈佛大学David Liu实验室将碱基脱氨基酶与CRISPR-Cas9系统有机组合，开发出了可实现目标碱基高效精准替换的新型编辑系统——碱基编辑器。碱基编辑器CBE和ABE的出现为点突变功能研究和人类遗传病治疗研究带来了巨大的变革，也开启了碱基编辑器工具研发的热潮。随着研究的深入，早期碱基编辑器的的多种缺陷与不足也引起了研究者的关注与重视。然而现有碱基编辑器ABE及其衍生工具的脱氨基酶均源自大肠杆菌的TadA（ecTadA），其它物种来源TadA同源蛋白在碱基编辑器开发中的潜力目前仍缺少研究。此外，传统碱基编辑器体积巨大，难以通过单一AAV病毒系统进行有效的体内递送，这也极大的限制了碱基编辑器的应用潜力。

       2023年1月26日，实验室与合作团队在Nature Communications杂志上发表了题为TadA orthologs enable both cytosine and adenine editing of base editors的论文。文章对其它物种的TadA同源蛋白系统性的改造与筛选，发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造构建出功能性的ABE、CBE或ACBEs。本研究首次证实TadA同源蛋白可通过简单的蛋白质工程化改造开发出多样化的碱基编辑器，为碱基编辑器的未来优化与改造提供了更多思路。

合作团队的前期工作证实nCas9的内部融合可增强碱基编辑器ABE的编辑活性并拓展活性窗口。本研究中团队发现，大肠杆菌来源的野生型ecTadA添加5’-NLS和3’-柔性接头序列并融合于nCas9内部的DS1249位点后，仅通过A106V和D108N双点突变便可获得具有明显腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的功能性碱基编辑器1249-NL-ecTadA（VN），其A5的A-G突变率为83%，C4的C-T突变率为27%。

  在此基础上，研究团队对近千种TadA同源蛋白进行了系统进化树分析，并挑选>50种其它物种来源的TadA同源蛋白进行类似的改造和功能筛选。结果发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造生成功能性的ABEs、CBEs和ACBEs（图1）。随后研究团队挑选数种有代表性的TadA同源蛋白衍生碱基编辑器进行安全性评估，发现其Cas9非依赖的DNA脱靶效应极低，而RNA脱靶效应在合理的点突变设计后有明显降低甚至接近本底水平。

图1 TadA同源蛋白改造用于功能性ABEs、CBEs和ACBEs的构建

总体而言，研究团队提供了TadA同源蛋白通过简单蛋白质工程化改造（单/双点突变）用于碱基编辑器开发的新思路，并证实了TadA同源蛋白用于包括ABE、CBE以及ACBE在内的各类碱基编辑器开发的可行性。该研究为碱基编辑器的开发提供了一种新的替代和简化策略，这对于开发具有独特编辑特性的碱基编辑器有非常重要的指导意义，也为脱氨基酶的潜在演化过程提供了思路。

此外，Nature Communications杂志同时发表了实验室与合作团队的题为TadA reprogramming to generate potent miniature base editors with high precision的论文。文章通过各类脱氨基酶与迷你CRISPR-Cas12f系统的组合筛选，首次开发出功能性的miniCBEs和具有全新活性窗口的miniABEs。此外，文章还对高活性脱氨基酶突变体TadA-8e的关键位点进行饱和突变筛选，实现了碱基编辑器ABE向ACBE和CBE的转变，并在此基础上开发出了具有单碱基编辑精度的miniCBEs工具。本研究系统性探索了迷你碱基编辑器的开发策略并验证了体内编辑的有效性，为迷你碱基编辑器的未来优化与改造奠定了基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36003-3

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36004-2